长期以来，人们对亚历山大的死因有不断的猜测和争议。大多数历史资料记载，亚历山大在巴比伦的一次痛饮后，得了疟疾，除此之外，伤寒也可能是另外一个凶手。还有理论认为他死于嚏根草中毒，密谋者可能包括他的妻子罗克珊娜，他的部将安提帕特以及他的老师亚里士多德。但是下毒的理论被Robin Lane Fox（《亚历山大传》的作者）所质疑，因为当时的古希腊缺乏作用时间长的毒药。
美国疾病控制和预防中心在2004年7月号《新型传染疾病》杂志里刊登了几篇论文，讨论了“亚历山大死于西尼罗河病毒”的说法。
亚历山大并未留下帝位的合法继承者，与他最亲近的是一位昏弱无能的异母兄弟。传说，当他的朋友在他临死前要求他指定一位继承人时，他含糊地说：“让最强者继承。”于是他死后，他的将领们企图瓜分这个帝国，引发了一些年轻军官对这种安排的不满，继而发生一连串的战争，在这场斗争中，亚历山大的母亲、妻子和孩子都横遭杀身之祸。
亚历山大死后，他的帝国被部下们继承和分裂。开始还保持了帝国形式上的统一，不久统治各块领地的首领们就陷入公开的争斗。最终，他们于公元前301年在弗里基亚的伊浦苏斯之役后结束了争斗。由3位胜利者托勒密、塞琉古、安提柯一世（独眼）瓜分了亚历山大帝国的版图，开启了希腊化时代。除了马其顿本土和最远的印度以外，亚洲部分由部将塞琉古继承，这就是后世和罗马的庞培、克拉苏等征战不休的塞琉古帝国。埃及由部将托勒密继承，这就是埃及的托勒密王朝，直传到后世和恺撒结婚的埃及艳后克莉奥佩特拉为止。
亚历山大的远征使希腊文明在中东和中亚繁盛发展，以及大夏——犍陀罗艺术在印度次大陆的发展，在文化上也产生了深远的影响。